TEST DI PATERNITA

1. Registrazione del campione

Nel momento in cui i campioni raggiungono il laboratorio, essi vengono registrati nel database del labortario. Vengono registrati il numero del caso e la data della consegna del campione.

Per il test di paternità Ufficiale/Legale, i campioni vengono in genere contrassegnati dalla data di nascita del donatore e dal numero di identificazione del caso. Queste due informazioni permettono l'esclusiva identificazione del campione, mantenendo l'anonimato del donatore al personale del lab. Una volta condotti i test, i risultati vengono emessi e consegnati alla persona richiedendo il test, la quale a sua volta può distribuirli ai corrispondenti donatori.

Per il test di paternità Fai da te, la persona responsabile per la registrazione del test, solitamente assegna un numero di identificazione al caso ed un numero del donatore singolare per ciascun campione, nel momento in cui essi arrivano al laboratorio. Nella maggior parte dei lab tutta l'informazione di natura personale è tenuta in un posto sicuro per garantire la confidenzialità. I campioni vengono identificati unicamente tramite il numero del caso e del donatore durante il processo del testing, e gli analisti del laboratorio non hanno accesso a nessun tipo di informazione personale sul donatore del campione. Una volta stabiliti i risultati, la persona responsabile abbina i numeri di identificazione ai corrispondenti donatori del campioni, e emette il resoconto del test.

 

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2. L' Estrazione del DNA

I campioni di saliva o di sangue che riceve il laboratorio contengono il materiale genetico necessario che viene analizzato nel test di paternità. Il materiale genetico è un elemento chimico noto come DNA (Deoxyribonucleic Acid), il quale si trova all'interno delle cellule umane.

Prima che il DNA possa essere analizzato, esso deve inanzi essere estratto e purificato da altri componenti trovati nel campione, un processo che richiede circa 2-3 ore. L'analista del laboratorio spinge fuori un piccolo cerchio dalla carta filtrante sulla quale è stato depositato il campione del donatore durante il processo del prelievo. Il cerchio di carta viene poi trasferito in una provetta sterilizzata, etichettata con il codice di identificazione del donatore. Il medesimo processo viene ripetuto per ciascun campione del test. I campioni vengono poi processati simultaneamente nelle proprie distinte provette etichettate.

La prima fase del processo di estrazione del DNA è quello di disgregare (lyse) le cellule in modo che venga rilasciato il DNA trovato all'interno. Tuttociò è ottenuto aggiungendo una soluzione speciale per degradare le componenti delle cellule indesiderate e lasciare così il DNA a galleggiare liberamente. La provette vengono poi inserite in una centrifuga e fatte girare ad alta velocità per diversi minuti. Questo fa sì che il DNA venga raccolto alla base della provetta a forma di una pallina compatta, e le altre componenti cellulari invece lasciati a galleggiare liberamente nella soluzione lisi che le circonda. La soluzione contenendo gli elementi contaminanti, viene estratta lasciando la pallina del DNA nella provetta. Il DNA viene poi ulteriormente purificato dagli elementi contaminanti lavando e rilavando le provette con una soluzione alcolica. Alla fine il DNA purificato viene dissolto in un liquido ed è pronto per la prossima fase.

 

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3. Amplificazione del DNA

OSi deve analizzare solo relativamente piccole sezioni del DNA di una persona per fare il test di paternità. Queste sezioni sono chiamati indicatori microsatelliti (microsatellite markers) o loci (vedi la sezione nly relatively small sections of a person's DNA need to be analysed in order to perform a paternity test. These sections are referred to as microsatellite markers or loci (see Processo del Test di Paternità per ulteriore informazione). La quantità del DNA estratta da un campione è piccola, allora prima che gli indicatori microsatelliti sono esaminati, devono essere prima copiati (o amplificati) millioni di volte in modo che ci siano abbastanza copie presenti per essere identificati. Questo processo di amplificazione è chiamato la Catena a Reazione della Polimerasi (PCR) e richiede circa 4 ore.

Ma come può l'analista del laboratorio controllare quali frammenti del DNA da amplificare? Il trucco sta nella conoscenza delle sequenze del DNA ad ogni estremità dei frammenti del DNA. Queste sequenze sono le stesse per ciascun essere umano ma allo stesso tempo uniche entro l'intero DNA umano. In altre parole, in ogni essere umano ciascuna di queste sequenze appare una sola volta lungo l'intera lunghezza del proprio DNA, così ogni coppia di sequenze demarca solamente il particolare marcatore microsatellitare che si trova tra di loro.

Per il PCR, inneschi (chiamate primers), vengono inserite nella soluzione del DNA purificato assieme ad una quantità di un'altra molecola speciale, o enzima, chiamata TAQ polymerase. Delle singole nucleotidi, che sono le parti costituenti del DNA, vengono aggiunte alla miscela.

Nella reazione PCR, per primo la doppia catena del DNA è esposta a una temperatura alta di circa 94 Centigrado in modo di denaturarla. A questa temperatura, la doppia elica si srotola e i legami fra i due filamenti del DNA si rompono, lasciando i due filamenti separati l'una dall'altra. Durante che la miscela si raffreddisce, gli inneschi aderiscano alle rispettive sequenze complimentari localizzate a ciascun lato della regione bersaglio. Il Taq Polimerasi riconosce il sito dove gli inneschi finiscono e a quel punto comincia a inserire gli oligonucleotidi, sintetizzando il filamento del DNA fra i due inneschi in una doppia catena del DNA. A questo punto finisce il primo ciclo del PCR.

Un ciclo PCR è dunque fatto da tre fasi:

Un periodo di denaturazione (a 94 gradi finchè il DNA diventa a fascia singola)
Un periodo di temperamento (a 50 - 60 gradi i primers si uniscono al DNA genomico)
Un periodo di estensione (a 72 gradi il Taq polymerase aggiunge i nucleotidi)
A questo punto, alla fine di ogni ciclo PCR i frammenti del DNA desiderati raddoppiano nel numero. Per il test di Paternità il ciclo PCR viene ripetuto per circa 40 volte, cosicchè alla fine della reazione PCR ci sono milioni di copie dei necessari frammenti del DNA.

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4. Analisi del DNA

Una volta amplificati, gli indicatori microsatellitari vengono messi in uno strumento chiamato analizzatore automatico del DNA, il quale separa i frammenti del DNA a seconda della misura. Nel test di paternità tutti i primers usati vengono munite di etichette fosforescenti. Questo permette all'analizzatore del DNA di identificare frammenti del DNA tramite il laser, e così misurarli. I dati sulle dimensioni vengono inseriti nel computer, un software speciale gli analizza e poi assegna un numero (il numero di volte che viene ripetuto) per ogni frammento.

Il processo di identificazione e di analisi richiede circa 5-7 ore, e il risultato finale viene illustrato in maniera grafica sul computer come dimostrano Es. 1 e Es. 2. Ogni indicatore microsatellitare appare come due vette, una per ogni copia complementare. La posizione della vetta è determinata dalla propria dimensione, così se due complementi genetici di un dato indicatore sono della stessa misura, appaiono sovrapposti come fossero una.

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5. Analisi delle statistiche

Una volta raccolti tutti i dati, e le loci dei distinti donatori sono stati paragonati, essi vengono inseriti in un software statistico che interpreta i risultati. Per un dato indicatore, se il numero di ripetizioni (o di frequenza) non combacia tra un bambino e il presunto padre, è molto probabile che quest'ultimo non sia il padre biologico. Esiste comunque, una vaga possibilità che la discrepanza può essere attribuita ad altre cause, come ad esempio una mutazione avvenuta tra padre e figlio. Allora la conclusione non può essere definitiva. Per ogni locus aggiuntivo nella quale varia la frequenza tra il presunto padre e il figlio c'è un incremento esponenziale nella probabilità che il presunto padre non sia il padre biologico. Infatti se le frequenze variano di tre o più loci è praticamente impossibile che l'uomo sia il vero padre biologico.

D'altro canto, un accoppiamento delle frequenze di un dato indicatore tra un presunto padre e il figlio può verificarsi per due ragioni. Potrebbe essere che il presunto padre sia il vero padre biologico. Comunque può anche essere attribuito al fatto che due donatori possano avere un' identica frequenza puramente per coincidenza. La probabilità che quest'ultimo caso accada dipende largamente dalle origini etniche dei donatori. Per questo motivo la base dati della poplazione a seconda di gruppi etnici o regioni geografiche viene in genere impiegata per calcolare le probabilità di un accoppiamento emerso se i due donatori non sono imparentati. (Per questo motivo alcuni laboratori richiedono le informazione sulle origini etniche dei donatori). La probabilità che il padre presunto sia il padre biologico aumenta con il numero di volte che gli indicatori genetici corrispondano fra lui ed il bambino. Per questa ragione è meglio scegliere i test che fanno uso di 12 o più indicatori. Infatti, se più di 10 indicatori corrispondono fra il bambino ed il padre presunto è praticamente certo che quest'ultimo sia il padre biologico.

Durante un test di paternità l'analista del laboratorio esamina i loci una ad una. Ogni volta che appare un accoppiamento tra il bambino e il presunto padre la frequenza osservata per un locus particolare viene ricercata in una base dati di una popolazione, e il valore di probabilità ottenuto viene inserito nel programma delle statistiche. Il programma valuta l'informazione e emette un risultato noto come indice di paternità per questo locus particolare. Dopo che tutti i loci vengono analizzati e inseriti, il programma compie l'indice di paternità combinato (combined paternity index) e la probabilità di paternità per l'intero test.

L'indice di paternità combinato è un grado verosimile che esprime il numero di volte che un individuo è più propenso ad essere il padre biologico quando paragonato ad una persona non imparentata e non testata, appartenente allo stesso gruppo etnico. Un indice di cento o più è considerato una netta evidenza genetica di parentela.

La probabilità di paternità viene definita come percentuale, e paragona la probabilità che l'individuo testato passi le particolari frequenze degl'indicatori alla probabilità che una persona (a caso), non testata, appartenente allo stesso gruppo etnico passi queste stesse frequenze. Se le frequenze del bambino/a e del presunto padre non combaciano in più di tre loci, il presunto padre viene totalmente escluso dalla possibiltà di paternità.

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6. La produzione del risultato

L'ultima cosa da fare nella procedura del Test di Paternità, è di effettuare un resoconto e spedirlo alla persona che ha richiesto il test. Il format del risultato del test di Paternità varia fra i laboratori, ma tutti i resoconti dovrebbero includere i seguenti componenti:
• Il numero di identificazione del caso.
• Un elenco dei campioni, compreso l'informazione riguardo all'identificazione ed i dati pertinenti come la data del prelievo del campione e la data quando è stato ricevuto al laboratorio.
• Una descrizione del metodo usato per eseguire il test.
• Una presentazione ed interpretazione dei risultati.
Esempi tipici di Resoconti del Test di Paternità si possono vedere cliccando sui titoli qui sotto:
Resoconto 1: I risultati indicano che il padre presunto
è in effetti il padre biologico.
Resoconto 2: I risultati escludono che il padre
presunto sia il padre biologico.

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