1.
Inscription du prélèvement
Quand les prélèvements
arrivent au laboratoire, ils doivent être iscrits dans la
base de données du laboratoire.
Les
prélèvements utilisés pour les test de paternité
à dispositions légales, sont en général
étiquétés avec la date de naissance de l'individu
et un numéro d'identification. Ces deux informations permettent
l'identification exclusive du prélèvement en gardant
l'identité de l'individu anonyme pour le personnel du laboratoire.
Une fois que les tests sont terminés, un rapport est présenté
au requérant du test. C'est lui qui réunit les résultats
aux personnes prélevées.
Pour
les tests de paternité non-juridiques (prélèvement
chez soi). Chaque prélèvement reçoit un numéro
d'identification quand ils arrivent au laboratoire. Dans la majorité
des laboratoires, tous les renseignements personnels sont gardés
dans un lieu protégé pour s'assurer qu'ils restent
confidentiels. Les laboratoires n'ont aucun accès à
ces informations confidentielles. Une fois que les résultats
sont definitifs, la personne responsable réunit le code
d'identification à la personne prélevée et
publie le rapport.
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2.
Extraction de l'ADN
Les prélèvements
de salive (frottis buccal) et les prélèvements sanguins
reçus par le laboratoire contiennent le matériel
génétique qu'il faut analyser dans le test de paternité.
Ce matériel est appelé ADN (acide désoxyribonucléique)
et se trouve dans la noyau (nucleus) des cellules du prélevées.
Avant
que l'ADN puisse être analysé, il doit être
d'abord extrait et purifié des autres éléments
du prélèvement, un procédé qui dure
à peu près 2-3 heures. Pour les prélèvements
de frottis buccal et les prélèvements de gouttes
de sang séché (voir la subdivision Rassemblement
des prélèvements pour des renseignements sur les
différents types de prélèvements), le laboratoire
découpe un petit cercle dans la papier filtre sur lequel
le prélèvement à été déposé
et le met dans un tube stérile et étiqueté
(avec le code d'identification de l'individu). En cas de prélèvement
sanguin, une quantité suffisante de sang est transférée
dans le tube étiqueté.
La
première étape pour l'extraction de l'ADN, est de
fragmenter les céllules pour libéres l'ADN des noyaux.
Les tubes sont ensuite mis dans une centrifugeuse dans laquelle
ils sont tournés à haute vitesse pendant plusieurs
minutes. L'ADN au fond du tube sous forme d'un grain dur, tandis
que les autres composants flottent dans la solution. Celle-ci
est enlevée et l'ADN restant est purifié davantage
en lavant le tube plusieurs fois avec une solution alcoolique.
Finalement, l'ADN est dissous dans un liquide. L'ADN est alors
prêt à être utilisé pour un test de
paternité.
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3.
Amplification de l'ADN
Il faut seulement analyser
des petits bouts d'ADN pour effectuer un test de paternité.
Ces parties sont appelées loci d'ADN microsatellite or
marqueurs microsatellite (voir la section Le test de paternité
pour se renseigner davantage). La quantité ADN extraite
du prélèvement est petite, donc avant que les loci
soient analysés, ils doivent d'abord être copiés
(ou amplifiés) un million de fois pour qu'il y ait assez
de copies existantes qui permettent la détection. Ce procédé
d'amplification s'appelle Polymerase Chain Reaction (PCR) et dure
à peu près 4 heures.
Mais
comment est-ce qu'un laboratoire peut contrôler les fragments
d'ADN à amplifier? La réponse se trouve dans la
connaissance de la séquence d'ADN qui encadre les fragments.
Chaque séquence encadrante est unique, c'est-à-dire
que son modèle d'ADN ne peut être trouvé nulle
part dans l'ADN humain entier. Par contre, ce modèle d'ADN
est identique parmi tous les êtres humains. Ainsi, le paire
de séquences encadrant un marqueur microsatellite identifie
le début et la fin d'un marqueur.
Pour
la technique PCR, des molécules particulières fabriquées
sur mesure (appelées primers) sont introduites dans la
solution d'ADN purifiée. Ces primeurs sont des molécules
d'ADN à brin unique qui sont conçues pour se rattacher
spécifiquement aux séquences uniques qui encadrent
les marqueurs microsatellite. Des nucléotides, uniques
(qui constituent le cadre d'ADN) ainsi qu'une quantité
d'une autre molécule particulière, l'enzyme, appelé
aussi Taq polymerase, sont ajoutés à la solution.
Dans
la réaction du PCR, l'ADN à double brin est d'abord
dénaturé en l'exposant à une température
élevée de 94 degrés Celsius environ. A cette
température, l'ADN se déroule et les liens entre
les deux brins se libèrent, laissant deux brins d'ADN uniques.
Ensuite, on laisse la solution refroidir. Pendant ce délai
du temps, les primeurs (primers) se lient avec leurs cibles aux
deux bouts des marqueurs ADN. Le Taq polymerase reconnaît
le lieu où le 'primer' se termine et c'est à ce
point qu'il commence à insérer des nucléotides:
reconstruisant le brin unique d'ADN entre les deux 'primers' et
le transformant en une molécule d'ADN à deux brins.
Ce procédé constitue la fin du dernier cycle de
la PCR.
Un
cycle PCR est donc constitué de trois étapes:
Une
phase de dénaturation (à 94 degrés jusqu'à
ce que l'ADN devient à brin unique)
Une phase de liaison (à 50-60 degrés les ' primers'
se lient à l'ADN génomique)
Une phase d'extension (à 72 degrés les Taq polymerase
ajoutent les nucléotides).
Ainsi, à la fin de chaque cycle de PCR, les fragments d'ADN
ciblés doublént en quantité. Pour le test
de paternité, le cycle de PCR est répété
40 fois environ, de façon à obtenir des millions
de copies des fragments d'ADN choisis à la fin de la réaction
PCR.
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4.
Analyse de l'ADN
Une fois que les marqueurs
microsatellite ont été amplifiés, ils sont
placés dans un instrument qu'on appelle analyseur d'ADN
automatique, qui sépare les marqueurs selon leur dimension.
Les 'primers' utilisés pendant le procédé
sont marqués au néon. Cela permet à l'analyseur
d'ADN de détecter les marqueurs d'ADN et mesurer leur dimension
à l'aide d'un laser. L'information sur la dimension des
marqueurs est entrée dans l'ordinateur et un logiciel spécial
examine les données et assigne un nombre de répétition
à chaque fragment.
Le
procédé de détection et d'analyse des données
dure à peu près 5 à 7 heures et le résultat
final donné sous forme graphique sur l'ordinateur comme
montré dans Exemple 1 et Exemple 2. Chaque marqueur apparaît
sous forme de deux pointes, chacune de ces pointes appartenant
à une copie complémentaire. La position de la pointe
est déterminée par sa dimension, ainsi si les deux
pointes génétiques d'un marqueur particulier sont
de la même taille, ils apparaissent comme superposés
en une seule pointe.
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5.
Analyse des statistiques
Une fois que les résultats
de tous participants ont été rassemblés,
ils sont entrés dans un logiciel de statistiques pour l'interprétation
des résultats. Si le nombre de répétitions
(ou fréquence) pour un marqueur particulier, ne correspond
pas entre un enfant et un père présumé, il
est fort probable que ce dernier n'est pas le père biologique
de l'enfant. Il y a, cependant, une faible probabilité
que la divergence dépende d'autres causes, comme par exemple,
une mutation qui peut survenir entre un père et un enfant.
Face à ces situations, on ne peut pas aboutir à
un résultat concluant avec certitude. Pour chaque locus
additionnel, dans laquelle la fréquence est différente
entre un père et un enfant, il y a une augmentation de
la probabilité que le père présumé
ne soit pas le père biologique. Par conséquent,
si les fréquences sont différentes dans trois loci
ou plus, il est presqu'impossible que le père présumé
soit le vrai père biologique.
D'autre
part, une correspondance des fréquences entre un père
présumé et un enfant pour un marqueur particulier
peut exister pour deux raisons. Une des raisons serait que le
père présumé soit en effet le père
biologique. Pourtant, il peut y arriver que les deux pères
présumés differents aillent par hasard des fréquences
identiques. La probabilité que ce cas arrive en réalité
dépend dans une grande mesure de l'origine ethnique des
individus. A cause de cette situation, les données de la
population qui sont définies par le groupe ethnique et
la localité géographique sont généralement
employés pour calculer la probabilité d'une 'harmonie'
si les deux pères présumés ne sont pas parentés.
(C'est la raison pour laquelle les laboratoires demandent des
renseignements sur l'origine ethnique des individus). Plus le
nombre des marqueurs correspondants entre un enfant et un père
présumé, plus la probabilité que ce dernier
soit le père biologique de l'enfant est grand. Pour cette
raison, il est beaucoup mieux de choisir des test qui utilisent
12 marqueurs ou plus. En effet, si plus de 10 marqueurs montre
un correspondance entre un enfant et un père présumé,
on est presque certain que le dernier soit le père biologique.
Pendant
un test de paternité, les laboratoires examinent les marqueurs
un par un. Quand l'enfant et un père présumé
sont parfaitement correspondants, la fréquence observée
dans le locus particulier est recherchée dans les donnés
de la population et la valeur de la probabilité obtenue
est saisie dans le logiciel des statistiques. Le programme transforme
l'information et on sort un résultat qui s'appelle paternity
index pour ce locus particulier. Quand tous les locis sont analysés
et saisis, le programme traite le index de paternité combiné
(combined paternity index) et la probabilité de paternité
pour tous les marquers.
L'index
de paternité combiné constitue un rapport de probabilité
qui exprime combien de fois un individu peut être le père
biologique quand on le compare avec un individu non-apparenté
et un individu de la même origine ethnique qui n'a pas été
tester. Un index de 100 ou plus est considéré comme
une preuve génétique très forte de paternité.
La
probabilité de paternité est exprimée par
un pourcentage. Si un père présumé n'est
pas le père biologique, le test de paternité produit
une probabilité de paternité de 0%. Si un père
présumé est le père biologique, le test de
paternité produit d'habitude une probabilité de
paternité de 99.99% ou plus.
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6.
Conclusion du test de paternité
La dernière étape
est de rédiger un rapport et de l'envoyer à la personne
concernée. La présentation du rapport du test de
paternité varie selon les laboratoires, mais tous les rapports
doivent inclure les éléments suivants:
Le
numèro d'identification de la cas.
Une liste de prélèvements, en induant des renseignements
sur l'identification et des données pertinentes comme la
date du prélèvement et la date de réception
au laboratoire.
Une description du procédé utilisé pour réaliser
le test.
Une présentation et une interprétation des résultats.
Le responsable du laboratoire doit signer et mettre une date au
rapport.
Des
exemples typiques de rapports de tests de paternité peuvent
être visualisés en cliquant sur les liens ci-dessous:
Rapport
1: Des résultats indiquant que le père
présumé est en réalité le père
biologique.
Rapport
2: Des résultats qui excluent que le père
présumé soit le père biologique.
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